一種基于結核分枝桿菌特異性鐵離子轉運蛋白IrtAB的新型熒光探針

　　近期，清華大學藥學院劉剛教授課題組在ACS Central Science發表了題為“Insights into IrtAB: Iron Transport Facilitates Ultrasensitive Detection of Mycobacteria in Both Cellular and Clinical Environments”的研究論文( https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c00676.)。

　　本研究報道了一種基于結核分枝桿菌特異性鐵離子轉運蛋白IrtAB的新型熒光探針，該探針具備鐵離子響應開關功能，實現了迄今為止在細胞水平和臨床菌學水平上對結核分枝桿菌最靈敏、超快速的檢測。

　　研究背景

　　結核病 (Tuberculosis，TB)是由單一病原體結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的傳染病。結核病最常見的是肺結核 (pulmonary TB)，會導致肺組織破壞，出現咳嗽、咳痰、咯血等癥狀，嚴重者可發展為呼吸衰竭。若未及時治療，結核菌可傳播至其他器官，導致結核性腦膜炎、骨結核、腎結核等。WHO研究報告顯示，2023年全球約有1080萬的新發結核病例和125萬的死亡病例[1]。自新冠之后 (COVID-19，2020 to 2021)，TB再次成為致死人數最多的單一病原體感染引起的疾病[2]。

　　菌學診斷是結核病確診的金標準，其中用于染色結核分枝桿菌細胞壁成分的金胺O法，已沿用超過百年。自2014年WHO在全球推廣Xpert MTB/RIF技術以來，結核病的診斷和年度新發病例的減少效率并未顯著提升，可能的原因包括：一是該技術檢測成本昂貴，在TB高負擔國家和地區普及困難，二是，高達約三分之一的新確診結核病患者已經產生耐藥性，該法并不能給出藥敏結果，用于精準指導用藥。因此，快速、高靈敏度的細菌學檢測方法仍然是研究的重點。單細胞熒光診斷技術因其高靈敏度、高特異性、快速檢測及較低成本等優勢，備受期待。目前雖然報道了一些基于代謝途徑和酶開關機制的Mtb熒光探針，但其靈敏度較低 (>100 μM)，響應時間長(>1 h)，且停留在實驗室水平，尚無臨床轉化的成果。

　　劉剛教授課題組長期致力于新型結核熒光探針的研究，先前報道了多個基于特異性硝基還原酶開關機制的新型Mtb熒光探針(Analytic Chemistry, 2024, 96, 4, 1576-1586;Chem Commun (Camb). 2021, 57, 13174-13177.)及藥敏實驗方法(ACS Infect. Dis. 2019, 5(6), 949-961)，同時實現了良好的標記宿主細胞內結核分枝桿菌能力。這些熒光團包括香豆素探針、花菁熒光探針及羅丹明熒光探針。

　　本研究則聚焦于結核分枝桿菌細胞膜上的鐵載體轉運蛋白IrtAB，利用其主動從外環境攝取并轉運極微量鐵離子的機制，開發出一種超靈敏且快速的新型熒光試劑

　　研究內容

　　研究首先對結核分枝桿菌自身分泌的鐵離子轉運蛋白IrtAB天然配體mycobactin (MbT)進行了結構修飾，并在分子骨架上分別引入S構型、R構型甲基，合成了不同的MbT類似物(圖1)，實現了該類多肽化合物的克級制備能力。研究系統考察了紅色熒光團，包括花菁系列熒光團 (Cy)和羅丹明系列熒光團 (Rho)，設計并合成了系列MbT-熒光團共綴探針 (MbTCFps，圖2)。

　　圖2 MbTCFps的化學結構

　　研究發現新型探針分子N14G相較于其它熒光分子，表現出最強的菌內熒光強度，且具有極高的靈敏度，在濃度低至1.0 nM條件下，依舊可以對M. smegmatis菌實現19倍的熒光增強作用;在10 nM條件下，只需5分鐘的孵育時間，即可實現134倍的熒光增強作用。共聚焦熒光顯微鏡成像顯示，N14G對M. smegmatis標記主要集中在細胞膜上，與IrtAB轉運蛋白在結核菌細胞膜上高表達密切相關。延長孵育時間至24小時，N14G依舊具有良好的熒光標記能力，證明N14G在孵育過程中具有優異的化學穩定性和光學穩定性。熱致死和抗TB藥物處理實驗結果顯示，細菌在死亡/損傷條件下，對N14G的攝取顯著降低，再次驗證了MbT轉運和細胞結構/膜結構的完整性密切相關。　　

　　分子對接顯示，N14G和N14G-Fe和IrtAB蛋白的結合部分(SID)均有較強的相互作用。采用IrtAB的敲除菌和回補菌再一次研究證明，熒光的產生依賴于IrtAB轉運蛋白(圖5)。　

　　與北京胸科醫院孫照剛教授合作研究證明，N14G和N14G-Fe對結核分枝桿菌野生株H37Rv的檢測限為34個菌落。對于臨床TB患者痰液的診斷，N14G和N14G-Fe也只需0.1 μM的濃度及10 分鐘染色時間就能有效標記TB患者痰液中的結核菌，其靈敏度遠超現有標準診斷試劑金胺O(圖6)。

　　總結

　　本研究以結核菌的膜轉運蛋白(IrtAB)為靶點，基于鐵載體的轉運機制和三價鐵離子控制的熒光開關機制，開發了新型結核菌熒光探針。這種熒光探針具有超高靈敏度(1-10 nm)和超快響應速度(5-10分鐘)的特點，可用于快速檢測結核分枝桿菌，尤其在臨床上可實現對結核病患者痰液的快速診斷。

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