從結(jié)構(gòu)上揭示分枝桿菌能量代謝機(jī)制

在一項(xiàng)新的研究中，中國科學(xué)院生物物理研究所的饒子和（Zihe Rao）院士、Quan Wang研究員、孫飛（Fei Sun）研究員及其同事們分離出恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的呼吸鏈超級復(fù)合物（respiratory supercomplex），并且利用低溫電鏡（cryo-EM）技術(shù)在3.5 ?的分辨率下可視化觀察它的三維結(jié)構(gòu)。這種細(xì)菌與結(jié)核分枝桿菌存在著密切的親緣關(guān)系，而且是一種用于研究許多細(xì)菌物種的流行模型。這種詳細(xì)的結(jié)構(gòu)揭示出電子如何在一種迄今為止觀察不到的過程中在細(xì)胞內(nèi)傳遞。相關(guān)研究結(jié)果于2018年10月25日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“An electron transfer path connects subunits of a mycobacterial respiratory supercomplex”。

通常，在細(xì)胞呼吸期間，能量來源（糖、脂肪酸和氨基酸）的氧化與電子受體（氧氣、硫、硝酸鹽和硫酸鹽）的還原偶聯(lián)在一起，從中可獲得化學(xué)能來合成三磷酸腺苷（ATP）和驅(qū)動細(xì)胞反應(yīng)。在有氧細(xì)胞呼吸中，這種化學(xué)能的產(chǎn)生方式是當(dāng)電子供體通過電子傳遞鏈（electron transport chain, ETC）傳遞到末端電子受體時(shí)產(chǎn)生一種稱為質(zhì)子動力勢（proton motive force, PMF）的跨膜質(zhì)子梯度，這種質(zhì)子動力勢可驅(qū)動ATP合成。在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員揭示了酶之間的電子傳遞存在直接關(guān)聯(lián)性，這代表著一種新的呼吸鏈催化模式。

醌和細(xì)胞色素是電子傳遞鏈中的兩種類型的電子載體，用于在嵌于膜中的較大的大分子結(jié)構(gòu)之間傳遞電子。四種膜氧化還原酶參與線粒體呼吸鏈的電子傳遞。它們包括復(fù)合物I（NADH:泛醌氧化還原酶, CI），復(fù)合物II（琥珀酸:泛醌氧化還原酶, CII），復(fù)合物III（bc1型泛醇;細(xì)胞色素c氧化還原酶，bc1型CIII）和復(fù)合物IV（aa3型細(xì)胞色素c氧化酶，aa3型CIV）。從功能上說，復(fù)合物CIII能夠?qū)⒎捍佳趸煞乎㈦娮觽鬟f給可溶性的細(xì)胞色素c。電子隨后被傳遞到復(fù)合物CIV，在那里氧氣被還原成水。跨膜PMF通過復(fù)合物CI、CIII和CIV中的質(zhì)子泵浦產(chǎn)生。

在原核生物的呼吸鏈中，情況更為復(fù)雜。由于這種復(fù)雜性，尚未在原核生物的細(xì)胞中確定完整的電子傳遞途徑。因此，有必要了解參與細(xì)菌電子傳遞的一種呼吸鏈超級復(fù)合物的完整結(jié)構(gòu)。在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員從恥垢分枝桿菌中提取出并純化了這種呼吸鏈超級復(fù)合物，并利用低溫電鏡技術(shù)在3.5 ?的分辨率下可視化觀察它的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)為揭示這種呼吸鏈超級復(fù)合物中的電子直接傳遞機(jī)制提供了重要的見解。這種呼吸鏈超級復(fù)合物的尺寸在200×70×120 ?的范圍內(nèi)，以一種對稱的線性結(jié)構(gòu)存在著，這完全不同于之前報(bào)道的呼吸鏈超級復(fù)合物。從組成上來說，線性的CIV1-CIII2-CIV1二聚體如此排列著以至于單個(gè)復(fù)合物CIV1位于中央的復(fù)合物CIII2二聚體的兩側(cè)。這種信息揭示了在電子傳遞過程中酶之間存在著直接的關(guān)聯(lián)性，這代表著一種新的呼吸鏈催化模式。這種詳細(xì)的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)有潛力協(xié)助開展抵抗分枝桿菌的藥物發(fā)現(xiàn)工作。

在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間，這些研究人員使用類似于結(jié)核分枝桿菌的過氧化氫抵抗性恥垢分枝桿菌突變株。培養(yǎng)這些細(xì)菌細(xì)胞，隨后按照之前描述的方法（Microbiology, 2006, 152:823-829, doi: 10.1099/mic.0.28723-0）分離它們的細(xì)胞膜。在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)、收集和裂解后，收集它們的細(xì)胞膜沉淀，接著提取出細(xì)胞膜中的呼吸鏈超級復(fù)合物。他們隨后利用光譜學(xué)方法、質(zhì)譜法和3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法描述了這種呼吸鏈超級復(fù)合物的特征。為了鑒定出血紅素基團(tuán)，按照之前的方法（Journal of Biological Chemistry, 2015, doi:10.1074/jbc.M114.624312），他們在連二硫酸鹽還原之前和之后通過記錄光譜來分析所選的部分樣品。他們使用天然質(zhì)譜法分析純化的呼吸鏈超級復(fù)合物樣品以便研究它的結(jié)構(gòu)，并且使用之前建立的實(shí)驗(yàn)方法分析這種呼吸鏈超級復(fù)合物中的單個(gè)結(jié)構(gòu)組分。

在低溫電鏡分析期間，這些研究人員使用乙酸雙氧鈾（1％, w/v）對5μl的濃度為0.05 mg/ml的恥垢分枝桿菌呼吸鏈超級復(fù)合物樣品進(jìn)行負(fù)染色，隨后利用在120kV下運(yùn)行的FEI Tecnai Spirit顯微鏡上拍攝圖片用于初始的結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建。他們通過處理來自負(fù)染色的呼吸鏈超級復(fù)合物樣品的53張顯微圖片，重建出這種呼吸鏈超級復(fù)合物的低分辨率結(jié)構(gòu)。為了完全重建這種呼吸鏈超級復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，他們在低溫電鏡圖片處理期間從8200張?jiān)紙D片中手工選擇出7600張。這項(xiàng)研究中的所有圖片都是利用PyMOL或UCSF chimera構(gòu)建出來的。

這些研究人員揭示出恥垢分枝桿菌CIII-CIV呼吸鏈超級復(fù)合物的低溫電鏡結(jié)構(gòu)。這種呼吸鏈超級復(fù)合物內(nèi)部的電子傳遞途徑的范圍從復(fù)合物CIII中的醌醇（quinol）氧化到復(fù)合物CIV中的氧氣還原。這些研究結(jié)果顯示了一種新的分叉電子傳遞機(jī)制，從而確保完成醌循環(huán)（Q cycle, 即質(zhì)子穿過脂質(zhì)雙層的凈運(yùn)動）而實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換。氧化物歧化酶（SOD）直接參與這種呼吸鏈超級復(fù)合物的組裝，能夠讓它免受活性氧（ROS）的氧化損傷。醌結(jié)合位點(diǎn)的分布也為在未來開發(fā)基于結(jié)構(gòu)的抗微生物藥物提供了一種框架。